Optimasi dan Uji Stabilitas Endo-ꞵ-1,4-D-Xilanase Rekombinan XynBTN63D dalam Host Saccharomyces Cerevisiae BJ1824 dari Fraksi Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC

Abstract

Endo-ꞵ-1,4-D-xilanase (EC 3.2.1.8) merupakan salah satu jenis xilanase yang bekerja dengan cara mengkatalisasi reaksi hidrolisis substrat xilan melalui reaksi pemotongan ikatan β-1,4 glikosida dalam rantai utama xilan secara acak. Endo-ꞵ1,4-D-xilanase pada penelitian ini berasal dari Bacillus sp. dalam sistem abdominal rayap yang kemudian dimutasi sisi katalitiknya dari asparagin (N) menjadi asam aspartat (D) pada posisi 63, sehingga disebut dengan XynBTN63D. Gen pengkode XynBTN63D tersebut dikloning pada plasmid yeast shuttle vector, yakni pESCURA dan pYHM1. Penggunaan plasmid yeast shuttle vector akan memungkinkan proses replikasi, seleksi, dan ekspresi pada 2 jenis sel yang berbeda, yaitu sel prokariot (Escherichia coli) dan eukariot (Saccharomyces cerevisiae). Endo-ꞵ-1,4- D-xilanase pengkode gen XynBTN63D yang sudah dikloning pada plasmid pESCURA dan pYHM1 ditransformasikan dalam host Saccharomyces cerevisiae BJ1824. Enzim yang dihasilkan kemudian dimurnikan dengan fraksinasi menggunakan amonium sulfat, dialisis, dan FPLC supaya dihasilkan karakteristik enzim yang lebih baik. Endo-ꞵ-1,4-D-xilanase pESC-XynBTN63D dan pYHM1-XynBTN63D yang dikarakterisasi pada penelitian ini berasal dari gabungan fraksi terbaik FPLC, yaitu pada fraksi 14, 15, dan 16. Karakterisasi dilakukan untuk mengetahui kondisi suhu, pH, dan waktu hidrolisis optimum, serta untuk mengetahui stabilitas suhu dan pH penyimpanan enzim. Optimasi suhu dilakukan dengan menghidrolisis substrat menggunakan enzim yang dilarutkan pada buffer fosfat sitrat pH 5.5 pada variasi suhu 30, 35, 40, 45, 50, dan 60°C selama 60 menit. Optimasi pH dilakukan dengan menghidrolisis substrat menggunakan enzim yang dilarutkan pada buffer fosfat sitrat variasi pH 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 7, dan 8 pada suhu optimum selama 60 menit. Optimasi waktu dilakukan dengan menghidrolisis substrat pada suhu optimum menggunakan enzim yang dilarutkan pada buffer fosfat sitrat pH optimum dengan variasi waktu 30, 45, 60, 90, 120, dan 180 menit. Stabilitas suhu dilakukan dengan mempreinkubasi enzim tanpa substrat pada variasi suhu 4, 16, 25, 30, 40, dan 50°C selama 1 jam. Stabilitas pH dilakukan dengan mempreinkubasi enzim tanpa substrat pada variasi pH 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 7, dan 8 pada suhu 4°C selama 24 jam. Penentuan aktivitas pada uji stabilitas dilakukan dengan menghidrolisis substrat dengan enzim sesuai kondisi suhu, pH, dan waktu optimumnya. Karakteristik kondisi optimum dan stabilitas endo-β-1,4-D-xilanase pESCXynBTN63D dan pYHM1-XynBTNEndo-β-1,4-D-xilanase pada penelitian ini telah berhasil ditentukan. Suhu optimum endo-β-1,4-D-xilanase baik pada pESCXynBTN63D maupun pYHM1-XynBTN63D adalah 40°C, di mana dihasilkan aktivitas sebesar 1,514U/mL untuk pESC dan 1,529U/mL untuk pYHM1. pH optimum endo-β-1,4-D-xilanase baik pada pESC-XynBTN63D maupun pYHM1- XynBTN63D adalah 5.5, di mana dihasilkan aktivitas sebesar 1,469U/mL untuk pESC dan 1,520U/mL untuk pYHM1. Waktu hidrolisis optimum endo-β-1,4-Dxilanase baik pada pESC-XynBTN63D maupun pYHM1-XynBTN63D adalah 45 menit, di mana dihasilkan aktivitas spesifik sebesar 1,321U/mL untuk pESC dan 1,533U/mL untuk pYHM1. Stabilitas suhu endo-β-1,4-D-xilanase baik pada pESCXynBTN63D maupun pYHM1-XynBTN63D dengan aktivitas relatif di atas 50% berada pada rentang 4-30°C. Artinya, endo-β-1,4-D-xilanase dari kedua plasmid tersebut lebih stabil jika disimpan pada suhu rendah. Stabilitas pH endo-β-1,4-Dxilanase baik pada pESC-XynBTN63D maupun pYHM1-XynBTN63D dengan aktivitas relatif di atas 50% berada pada rentang pH 4-6°C. Artinya, endo-β-1,4-Dxilanase dari kedua plasmid tersebut lebih stabil jika disimpan pada kondisi yang cenderung asam.