Purifikasi Protein Rekombinan Kandidat Vaksin Tuberkulosis Multi-Epitope MTP_Ag85a dengan Kromatografi Afinitas

Abstract

Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit infeksi menular yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis dan masih menjadi salah satu penyebab kematian tertinggi akibat penyakit infeksi di dunia. Vaksin Bacillus Calmette-Guérin (BCG) yang saat ini digunakan secara luas memiliki keterbatasan karena belum mampu memberikan perlindungan optimal terhadap TB paru pada orang dewasa, serta hanya menginduksi imunitas sistemik tanpa disertai imunitas mukosa yang memadai. Pendekatan vaksin subunit berbasis multi-epitop dinilai lebih aman dan menjanjikan sebagai alternatif, salah satunya melalui protein rekombinan MEMTP_Ag85A yang menggabungkan epitop imunogenik dari Mycobacterium tuberculosis curli pili (MTP) dan Antigen 85A (Ag85A) dalam satu konstruk protein fusi. Protein MEMTP_Ag85A telah berhasil diekspresikan pada penelitian sebelumnya menggunakan Escherichia coli BL21 (DE3) yang membawa plasmid pET-30a, namun hasil ekspresi tersebut masih bercampur dengan protein sel inang sehingga belum memenuhi standar kemurnian yang dibutuhkan untuk pengembangan vaksin. Protein ini dirancang dengan tag 6xHis pada ujung N dan C terminal sehingga dapat dimurnikan menggunakan kromatografi afinitas berbasis resin Ni-NTA. Hingga saat ini belum tersedia data mengenai kondisi optimal purifikasi protein rekombinan MEMTP_Ag85A menggunakan kromatografi afinitas pada sistem FPLC. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk menentukan kondisi optimal purifikasi protein rekombinan MEMTP_Ag85A menggunakan FPLC dengan kromatografi afinitas Ni-NTA, menganalisis profil pita protein hasil purifikasi berdasarkan analisis SDS-PAGE dan mengonfirmasi identitasnya melalui Western Blot, serta mengukur kadar protein hasil purifikasi berdasarkan Bradford assay. Proses purifikasi protein rekombinan MEMTP_Ag85A dilakukan menggunakan sistem Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) ÄKTA go dengan kolom HisTrap 5 mL berbasis resin Ni Sepharose High Performance. Protein diperoleh dari isolat E. coli BL21 (DE3) yang membawa plasmid pETMEMTP_Ag85A, dilisiskan, kemudian dimurnikan melalui tahapan ekuilibrasi, pengikatan sampel, pencucian protein non-spesifik, dan elusi menggunakan gradien linear imidazol 20–500 mM selama 10 volume kolom (CV) pada laju alir 5 mL/menit. Fraksi hasil purifikasi dianalisis menggunakan SDS-PAGE 12% untuk melihat profil kemurnian, dikonfirmasi identitasnya menggunakan Western Blot dengan antibodi primer rabbit anti-His-tag dan antibodi sekunder AP Goat antirabbit, serta ditetapkan kadar protein totalnya menggunakan metode Bradford assay dengan kurva standar bovine serum albumin (BSA). Hasil purifikasi menggunakan kromatografi afinitas Ni-NTA menunjukkan bahwa protein target berhasil dimurnikan, ditandai dengan ditemukannya pita protein tunggal pada berat molekul sekitar 31,6-32 kDa pada fraksi elusi ke-31, 32, dan 33, yang dielusi pada rentang konsentrasi imidazol 393 hingga 417 mM. Hasil penetapan kadar protein dengan metode Bradford assay diperoleh kadar protein tertinggi pada fraksi elusi ke-31 sebesar 314,20 µg/mL, yang menurun berturutturut pada fraksi elusi ke-32 sebesar 124,22 µg/mL dan fraksi elusi ke-33 sebesar 97,84 µg/mL. Analisis Western Blot menggunakan antibodi rabbit anti-His-tag menunjukkan pita positif yang konsisten pada berat molekul yang sama sehingga mengonfirmasi identitas protein hasil purifikasi sebagai protein rekombinan MEMTP_Ag85A. Temuan ini menunjukkan bahwa strategi purifikasi yang diterapkan berhasil menghasilkan protein rekombinan MEMTP_Ag85A dengan tingkat kemurnian tinggi, sehingga berpotensi untuk dikembangkan lebih lanjut sebagai kandidat vaksin tuberkulosis berbasis epitop.