KARAKTERISASI SUCROSE-PHOSPHATE SYNTHASE (SPS1) DARI TEBU PADA Escherichia coli STRAIN BL21

Abstract

Sukrosa merupakan produk akhir dari poses fotosintesis yang terjadi di daun. Pada sebagian besar tanaman sukrosa dibentuk di sitosol dan ditransportasikan melalui floem dari jaringan pembentuk ke jaringan penyimpan. Metabolisme sukrosa pada tanaman dipengaruhi oleh beberapa enzim yaitu Invertase, Sucrose Synthase, dan Sucrose-Phosphate Synthase. Sucrose-Phosphate Synthase (SPS; E.C. 2. 4.1.14) adalah enzim yang mempunyai peranan penting dalam proses biosintesis sukrosa pada tanaman. Karakterisasi enzim SPS pada tanaman tebu dalam bentuk murni belum pernah dilakukan karena keberadaan enzim ini sangat rendah dan mudah mengalami degradasi selama purifikasi. Saat ini tersedia cDNA SoSPS1 yang dikontruksi pada vektor plasmid pTrc99A, maka karakterisasi enzim yang dikode SPS1 dapat dikarakterisasi. Karakterisasi gen dapat dilakukan dengan sel biologi misalnya E. coli. E. coli sering digunakan sebagai inang vektor dikarenakan dapat tumbuh pada medium sederhana, pertumbuhannya cepat, pengetahuan tentang informasi genetik dan sifat biokimianya sudah banyak dipelajari Penelitian ini bertujuan untuk mentransformasi dan mengetahui kondisi optimal ekspresi serta karakterisasi gen pengkode SPS1 dari tanaman tebu yang telah disisipkan pada vektor ekspresi pTrc99A dalam E. coli strain BL21. Penelitian ini akan dilakukan transformasi, konfirmasi keberadaan gen pengkode SPS1, dan pengaruh suhu terhadap ekspresinya serta karakterisasi protein yang dihasilkan oleh E. coli. Transformasi plasmid pTrc99A-SoSPS1 ke dalam E. coli dilakukan dengan perlakuan CaCl dan Heat-shock. Konfirmasi keberadaan gen pengkode SPS1 dengan penambahan antibiotik pada media dan analisis enzim restriksi. Pengujian ekspresi dilakukan dengan menumbuhkan E. coli dalam media dengan pelakuan suhu. 2 viii Karakterisasi enzim dilakukan dengan substrat SPS1 yaitu Uridine Diphosphoglucose (UDPGlc) dan Fructose-6-Phosphate (Fru6P). Hasil penelitian menunjukkan bahwa E. coli BL21 tertransformasi dan mengandung plasmid pTrc99A-SoSPS1. Penambahan antibiotik dan analisis enzim restriksi telah dilakukan untuk konfirmasi keberadaannya. E. coli mampu mengekspresikan gen pengkode SPS1 dan menghasilkan aktivitas enzim optimal pada suhu induksi 22 o C. Analisis dengan Western Blot menunjukkan bahwa protein SPS1 dari E. coli transforman berhasil dideteksi. Nilai Km dan V enzim SPS1 dengan substrat UDPGlc adalah 16,69 mM dan 3,06 µg sukrosa/ menit/µg protein. Sedangkan nilai Km dan V maks ix maks enzim SPS menggunakan substrat Fruc6p sebesar 0,927 mM dan 1,20 µg sukrosa/ menit/µg protein.