Uji Aktivitas Anti-Inflamasi secara In-Vitro dari Ekstrak Etanol Kulit Buah Kakao (Theobroma cacao L.) dengan Metode Denaturasi Protein dan Anti-Proteinase

Abstract

Inflamasi merupakan respon sistem kekebalan tubuh terhadap suatu rangsangan. Inflamasi ini bertindak dengan menghentikan rangsangan dan segera memulai proses penyembuhan. Denaturasi protein dan proteinase merupakan beberapa faktor penyebab dari inflamasi. Untuk mempercepat penyembuhan inflamasi dapat menggunakan obat anti-inflamasi nonsteroid (OAINS), seperti natrium diklofenak. Terlepas dari manfaatnya, natrium diklofenak memiliki efek samping seperti ulserasi gastrointestinal, trombositopenia, gangguan ginjal dan sistem saraf pusat (SSP), serta alergi. Untuk menghindari efek samping tersebut, maka perlu membuat alternatif lain seperti pemanfaatan kulit buah kakao untuk anti-inflamasi. Kulit buah kakao ini dilaporkan banyak mengandung senyawa metabolit sekunder aktif seperti flavonoid yang berpotensi menjadi agen anti inflamasi. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas anti-inflamasi dari ekstrak etanol kulit buah kakao dibandingkan dengan natrium diklofenak melalui penghambatan denaturasi protein dan proteinase yang dilihat dari persentase penghambatan dan nilai IC50. Uji denaturasi protein dilakukan dengan membuat larutan uji pada konsentrasi 1, 2, 4, dan 12 µg/mL, kontrol positif pada konsentrasi 12, 14, 16, dan 20 µg/mL, dan kontrol negatif yang terdiri dari metanol. Masing-masing larutan diambil 50 µl dan ditambahkan dengan BSA 0,2% ad 5 mL dan campuran diinkubasi selama 30 menit pada suhu 25 ºC, lalu dipanaskan menggunakan waterbath suhu 72 ºC selama 5 menit dan didinginkan. Campuran divortex dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 660 nm pada spektrofotometri UV-Vis dengan menggunakan blanko yang terdiri dari TBS pH 6,2-6,5. Uji anti-proteinase dilakukan dengan membuat larutan uji pada konsentrasi 1, 2, 4, dan 12 µg/mL, kontrol positif pada konsentrasi 12, 14, 16, dan 20 µg/mL, dan kontrol negatif yang terdiri dari etanol 96%. Masing-masing larutan diambil 1 mL, lalu ditambahkan dengan 2 mL larutan yang mengandung 0,06 mg tripsin dan 1 mL dapar tris-HCl 20 mM (pH 7,4). Campuran diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 10 menit, lalu ditambahkan 1 ml larutan kasein 0,65% dan diinkubasi kembali selama 20 menit. Pada akhir inkubasi, campuran ditambahkan dengan 2 ml asam perklorat 70%. Campuran disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Supernatan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 280 nm menggunakan spektrofotometri UV-Vis dengan menggunakan blanko yang berisi tris-HCl 20 mM. Data absorbansi diolah sehingga didapatkan persen penghambatan dan nilai IC50. Masing-masing data IC50 dari uji denaturasi protein dan proteinase diolah dan diuji normalitas dengan menggunakan Shapiro-Wilk dan diuji homogenitasnya dengan menggunakan Levene’s test. Jika hasil memenuhi persyaratan dilanjutkan dengan uji independent t-test. Data dikatakan berbeda signifikan apabila nilai p<0,05 dengan menggunakan taraf kepercayaan 95%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas penghambatan denaturasi protein dari ekstrak etanol kulit buah kakao (Theobroma cacao L.) lebih besar daripada natrium diklofenak, namun nilai keduanya tidak berbeda signifikan dengan nilai IC50 dari ekstrak sebesar 16,542 ± 3,095 µg/mL, sedangkan IC50 dari natrium diklofenak sebesar 21,524 ± 5,259 µg/mL. Pada uji anti-proteinase diketahui bahwa aktivitas penghambatan proteinase dari ekstrak etanol kulit buah kakao (Theobroma cacao L.) lebih kecil dari pada natrium diklofenak dan nilai keduanya berbeda signifikansi dengan nilai IC50 dari ekstrak sebesar 100,691 ± 7,663 µg/mL, sedangkan IC50 dari natrium diklofenak sebesar 73,974 ± 4,436 µg/mL. Berdasarkan data tersebut, dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol kulit buah kakao memiliki aktivitas anti-inflamasi.