Subkloning dan Ekspresi 1/2 SLPI Domain C dalam Plasmid pGEX-4T-2 pada Escherichia coli BL21(DE3)

Abstract

Secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI) adalah protein berukuran 11,7 kDa yang mengandung 107 asam amino dengan dua domain WFDC [WAP (whey acidic protein) four-disulfide core]. Di dalam tubuh, SLPI berfungsi mengendalikan aktivitas neutrofil elastase dan mencegah proses inflamasi berlebihan. Pada beberapa kasus inflamasi kronis, SLPI endogen dari tubuh akan di-inaktivasi, sehingga memerlukan agen antiinflamasi. Pengembangan pengetahuan bioteknologi protein rekombinan berhasil mensintesis SLPI yang dapat diproduksi dengan inang Escherichia coli. SLPI rekombinan yang diproduksi dengan metode protein rekombinan telah diaplikasikan dalam pengobatan cystic fibrosis. Produksi protein rekombinan dalam bentuk terlarut dan aktif masih menjadi batasan overekspresi protein rekombinan. Di antara 8.048 protein rekombinan yang menggunakan sistem ekspresi Escherichia coli, hanya 30% yang ditemukan diekspresikan dalam bentuk yang dapat larut, sedangkan sisanya berada dalam bentuk agregat pada badan inklusi. Beberapa faktor yang mempengaruhi ekspresi protein rekombinan dalam bentuk terlarut seperti: vektor ekspresi; strain inang; ukuran protein rekombinan; suhu inkubasi dan konsentrasi induser;. Aktivitas antiprotease SLPI diketahui berada pada 1/2 SLPI domain C (SLPIc). Dengan mengekspresi 1/2 SLPI domain C, tingkat agregasi akibat kesalahan pelipatan dapat dikurangi. Penelitian sebelumnya telah berhasil melakukan konstruksi vektor pGEX-4T-2 yang membawa gen pengkode SLPIc. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui pengaruh konsentrasi IPTG dan suhu inkubasi pasca induksi terhadap level ekspresi SLPIc. Subkloning dilakukan dengan mentransformasikan vektor ekspresi pGEX4T-2-SLPIc yang telah diisolasi dari E coli TOP10 ke dalam inang ekspresi E. coli BL21(DE3). Vektor pGEX-4T-2-SLPIc pada sel inang ekspresi kemudian diidentifikasi keberadaannya dengan melakukan isolasi plasmid, restriksi, dan sequensing. Setelah dipastikan keberadaan vektor pGEX-4T-2-SLPIc, E. coli BL21(DE3) pGEX-4T-2 diinkubasi dalam empat kelompok suhu dengan tiap kelompok suhu diinduksi variasi IPTG 0 mM; 0,1 mM; 0,5 mM; dan 1 mM. Hasil ekspresi diisolasi kemudian dianalisis SDS-PAGE. Protein target overekspresi E coli BL21(DE3) pGEX-4T-SLPIc berupa protein fusi yang terdiri dari GST dan SLPIc. Protein fusi ini berukuran 34,1 kDa. Ketebalan pita protein target glutathione-S-transferase-1/2 SLPI domain C (GST-SLPIc) dianalisis menggunakan aplikasi ImageJ. Identifikasi vektor ekspresi pGEX-4T-2-SLPIc dengan restriksi dan sequensing menyatakan E. coli BL21(DE3) yang hasil transformasi membawa plasmid pGEX-4T-2-SLPIc. Dari hasil pengukuran area puncak pita protein target menggunakan aplikasi imageJ, konsentrasi IPTG optimal untuk overekspresi sebesar 0,1 mM. Suhu optimal untuk menghasilkan protein target dalam jumlah terlarut adalah 37 °C