Desain dan Konstruksi sgRNA-pRGEB32 untuk Target Mutasi Gen Peregulasi Karotenoid PSY dan Flavonoid MYB pada Tanaman Tomat

Abstract

Gen Phytoene Synthase 1 (PSY1) dan MYB12 merupakan gen penting yang berperan dalam biosintesis karotenoid dan flavonoid pada buah tomat (Solanum lycopersicum). Gen PSY1 berfungsi mengkatalisis tahap awal biosintesis karotenoid yang berpengaruh terhadap pembentukan likopen, sedangkan MYB12 merupakan faktor transkripsi yang mengatur biosintesis flavonoid sebagai senyawa yang berperan dalam kualitas nutrisi dan aktivitas antioksidan buah. Penelitian ini menggunakan teknologi CRISPR/Cas9 dengan vektor pRGEB32 untuk merancang konstruksi penyuntingan gen yang menargetkan PSY1 dan MYB12. Penelitian bertujuan untuk merancang dan memvalidasi konstruk CRISPR/Cas9 melalui pendekatan bioinformatika, konstruksi molekuler, transformasi bakteri, dan konfirmasi sekuens sebelum diaplikasikan pada transformasi tanaman. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Agrobioteknologi, Fakultas Pertanian, Universitas Jember. Hasil penelitian menunjukkan bahwa sgRNA yang dirancang memiliki spesifisitas tinggi terhadap gen target berdasarkan analisis bioinformatika. Konstruk pRGEB32::PSY1 dan pRGEB32::MYB12 berhasil dibangun, dikonfirmasi melalui elektroforesis, PCR koloni, transformasi ke Escherichia coli dan Agrobacterium tumefaciens, serta hasil sekuensing yang menunjukkan integrasi sgRNA sesuai desain. Validasi in silico menggunakan AlphaFold, PyMOL, ORF Finder, dan BLASTP menunjukkan bahwa mutasi knock-out menyebabkan perubahan struktur dan fungsi protein target. Hasil penelitian ini membuktikan bahwa konstruk CRISPR/Cas9 yang menargetkan gen PSY1 dan MYB12 berhasil dikembangkan dan layak digunakan untuk transformasi tanaman tomat pada penelitian selanjutnya.