Pengujian Aktivitas Antiprotease Protein SLPI Rekombinan Hasil Ekspresi pada Escherichia coli yang Mengandung Plasmid pET32b

Abstract

Pada penelitian sebelumnya, telah dilakukan tahap subkloning plasmid rekombinan pET32b SLPI pada Escherichia coli BL21 serta optimasi suhu ekspresi dan induksi IPTG. Konsentrasi IPTG yang perlu ditambahkan sebesar 0,5 mM dan inkubasi pada suhu 30°C. Pada penelitian ini dilakukan proses purifikasi dan uji aktivitas antiprotease untuk mendapatkan protein SLPI rekombinan murni yang berperan sebagai agen terapi antiprotease eksternal. Protein SLPI rekombinan berhasil dimurnikan menggunakan sistem Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) dengan metode Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) berbasis resin Ni-NTA. Elusi dilakukan secara bertahap menggunakan gradien imidazol dengan konsentrasi 20–500 mM dalam volume total 10 kali volume kolom (10 CV) dan laju alir 5 mL/menit. Hasil pemurnian kemudian dianalisis

menggunakan elektroforesis SDS-PAGE untuk melihat profil protein. Hasil SDSPAGE menunjukkan adanya pita tunggal berukuran ~29 kDa pada fraksi elusi ke23 hingga ke-31, yang diduga merupakan protein SLPI rekombinan. Hasil ini dikonfirmasi menggunakan metode western blot, dimana terdapat pita berwarna gelap pada posisi serupa yang mengonfirmasi keberadaan protein target pada hasil pemurnian. Uji aktivitas antiprotease dilakukan secara spektrofotometri dengan menggunakan enzim Porcine Pancreatic Elastase (PPE) dan substrat spesifik NSuccinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide

(SANA) yang diamati pada panjang gelombang maksimum 410 nm. SLPI bekerja dengan menghambat interaksi antara PPE dan SANA, sehingga pembentukan produk ρ-nitroanilin dapat ditekan. Uji aktivitas menggunakan fraksi elusi ke-23 yang telah dikuantifikasi kadarnya menggunakan metode Bradford dan diperoleh kadar sebesar 1298,21 ± 152,57 µg/mL. Uji aktivitas antiprotease dilakukan dengan variasi volume penambahan sampel untuk memperoleh lima titik konsentrasi berbeda. Data persen penghambatan kemudian diplot terhadap log konsentrasi SLPI (µM), dan nilai IC₅₀ dihitung menggunakan pemodelan regresi non-linier melalui perangkat lunak GraphPad Prism 9. Hasil menunjukkan bahwa SLPI rekombinan memiliki aktivitas antiprotease dengan nilai IC₅₀ sebesar 19,23 µM. Temuan ini membuktikan bahwa protein SLPI rekombinan memiliki aktivitas sebagai antiprotease. Penelitian selanjutnya perlu dilakukan uji aktivitas antiinflamasi SLPI rekombinan secara in vitro untuk mendukung pengembangan SLPI rekombinan sebagai kandidat terapi penyakit inflamasi kronis seperti PPOK. Selain itu, protein SLPI rekombinan yang berhasil dimurnikan perlu diformulasikan ke dalam sediaan terapeutik dan diuji efektivitasnya melalui uji aktivitas secara in vivo menggunakan model hewan percobaan