Uji Aktivitas Penghambatan Protease Protein 1/2 SLPI Domain C Hasil Ekspresi pada Plasmid pGEX-4T-2 dalam Escherichia coli BL21 (DE3)

Abstract

Penyakit rheumatoid arthritis (RA) merupakan penyakit autoimun sistemik yang ditandai dengan kerusakan dan erosi tulang akibat peradangan sendi dalam jangka waktu yang lama. Pada penyakit RA, terjadi pembentukan autoantibodi berupa rheumatoid factor (RF) dan anti-citrullinated protein antibodies (ACPA) yang berkontribusi terhadap inflamasi pada sendi, sehingga memicu pelepasan enzim proteolitik. Enzim proteolitik salah satunya yaitu protease serin berperan dalam hidrolisis protein dengan cara memutus ikatan peptida. Dalam keadaan normal dan cukup, protease serin bertanggung jawab atas mekanisme pertahanan dalam inflamasi melalui pemecahan jaringan yang rusak. Namun, dalam kondisi patologis, jumlah protease serin yang berlebih dapat mengakibatkan kerusakan jaringan yang tidak terkendali. Protein Secretory Leukocyte Protease Inhibitor (SLPI) merupakan inhibitor protease serin yang berperan penting dalam menjaga keseimbangan protease dan antiprotease. Aktivitas antiprotease dari protein SLPI terdapat pada domain C saja, sedangkan domain N memiliki aktivitas sebagai antibakteri. Oleh karena itu, pada penelitian ini digunakan 1/2 SLPI domain C (SLPIc) yang mengandung domain utama sebagai antiprotease. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan protein SLPIc dalam menghambat aktivitas elastase, yang merupakan salah satu enzim dari kelompok protease serin. Pada penelitian oleh Ahmad (2021), protein SLPIc rekombinan berukuran ~34 kDa berhasil diekspresikan dalam plasmid pGEX-4T-2 pada Escherichia coli BL21 (DE3). Protein rekombinan tersebut telah difusikan dengan tag GST untuk meningkatkan kelarutan protein dan 6x HisTag untuk memfasilitasi pemurnian protein. Protein pada E. coli yang telah dilakukan produksi dan overekspresi menggunakan inducer IPTG 0,1 mM selanjutnya dimurnikan melalui metode immobilized metal-affinity chromatography (IMAC) menggunakan kolom Ni-NTA berbasis sistem FPLC. Pemurnian dilakukan menggunakan pengkelat logam berupa imidazol dengan konsentrasi bertingkat (20-500 mM) untuk proses elusi protein. Dari seluruh fraksi yang tertampung, beberapa fraksi dilakukan elektroforesis SDS-PAGE untuk melihat kemurnian protein. Selanjutnya, dilanjutkan dengan analisis Western blot untuk mengonfirmasi protein target SLPIc menggunakan antibodi primer berupa anti-SLPI. Uji aktivitas penghambatan protein SLPIc dilakukan terhadap enzim porcine pancreatic elastase (PPE) dengan substrat N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (SANA) yang merupakan substrat spesifiknya. Hasil penghambatan dinyatakan sebagai persentase inhibisi dan nilai 50% inhibitory concentration (IC50) dari protein SLPIc terhadap enzim PPE. Hasil penelitian menunjukkan bahwa protein SLPIc rekombinan berhasil dimurnikan menggunakan kolom kromatografi afinitas Ni-NTA pada sistem FPLC. Fraksi murni terelusi ketika konsentrasi imidazol 307,5 mM dan dibuktikan dengan diperolehnya pita protein tunggal pada gel SDS-PAGE. Pita protein tunggal yang diperoleh pada fraksi 24 memiliki berat molekul ~31 kDa yang diduga merupakan protein SLPIc. Selain itu, hasil analisis Western blot mendeteksi keberadaan protein SLPIc berukuran ~33 kDa pada membran nitroselulosa. Dalam aktivitas penghambatannya, protein SLPIc menghambat enzim PPE dengan diperolehnya nilai IC50 sebesar 2,436 μM. Hasil tersebut menginterpretasikan bahwa pada konsentrasi 2,436 μM protein SLPIc dapat menghambat sejumlah 50% dari aktivitas enzim PPE.