Analisis Protospacer Adjacent Motif (PAM) Sequence pada S-gene SARS-CoV-2 Strain Indonesia melalui Pendekatan In Silico dan Pemanfaatannya sebagai Book Chapter

Abstract

Awal tahun 2020, terjadi wabah penyakit Coronavirus Disease-19 (COVID-19) di seluruh dunia, termasuk Indonesia yang disebabkan oleh virus SARS-CoV-2. SARS-CoV-2 merupakan virus ssRNA+ dengan panjang 26-32 kb yang tersusun dari bermacam-macam protein. Salah satunya protein spike yang berperan penting dalam proses jalan masuknya virus ke dalam sel inang dan memiliki antigenitas yang tinggi (Martínez-Flores et al., 2021). Penelitian SARS-CoV-2 dengan teknik genome editing berbasis sistem CRISPR/Cas menjadi salah satu perkembangan teknologi penelitian yang dapat digunakan untuk penelitian diagnostik molekuler karena mengandalkan kemampuan sistem kekebalan tubuh pada prokariot yang berperan dalam melidungi dan melawan adanya struktur asing (Singh & Dhar, 2020). Sistem CRISPR/Cas perlu memiliki Protospacer Adjacent Motif (PAM). Analisis sekuens PAM penting untuk dilakukan karena PAM berperan untuk menyelipkan DNA target sesegera mungkin ketika protein Cas sudah mengenali DNA asing, serta berperan sebagai pengunci dan berperan untuk membedakan DNA “self” dan “nonself” (Khan & Duceppe, 2021). Pencarian PAM disertai dengan urutan sekuens yang melengkapinya dilakukan dengan melakukan skrining pada laman CHOPCHOP, kemudian target-target sesuai kriteria dipilih dan diuji dengan melakukan docking, resprox, dan karakterisasi. Hasil analisis PAM dan sekuens target yang didapatkan adalah 2 sekuens target dari Cas9 dan 3 sekuens target dari Cas12a. Urutan sekuens CTCAGACTAATTCTCCTCGG dengan PAM CGG (target 2) dan urutan sekuens CTCAGACTAATTCTCCTCGG dengan PAM GGG (target 5) terpilih menjadi target protospacer yang optimum pada Cas9. Untuk Cas12a, urutan sekuens GCAGAGACATTGCTGACACTACTG dengan PAM TTG (target 1), ATGAAGACGACTCTGAGCCAGTG dengan PAM TTTG (target 9), ATGAAGACGACTCTGAGCCAGTG dengan PAM TTTG (target 12). Kelima sekuens target tersebut terpilih karena memiliki skor docking paling negatif. Semakin negatif nilai docking yang didapatkan maka menunjukkan semakin kuat ikatan yang terjadi pada molekul tersebut. Selain uji docking, target sekuens yang telah terpilih diuji ResProx untuk mengetahui kerapatan dan ikatan molekul dengan resolusi sinar-X. Kelima sekuens menunjukkan nilai resolution yang cukup beragam, yaitu target 2 2,18 Å, target 5 2,23 Å, target 1 2,84 Å, target 9 2,87 Å, dan target 12 2,85 Å. Nilai resolution yang berbeda tersebut menunjukkan perbedaan struktur, model, serta daya ikat suatu molekul. Hasil karakterisasi pada target terpilih juga menunjukkan hasil yang optimum karena kelima target memiliki nilai konten GC ≥50%. Konten GC memiliki fungsi penting karena berkaitan dengan kekuatan ikatan dan mempengaruhi stabilitas rantai nukleotida. Semakin tinggi konten GC maka semakin banyak ikatan hidrogen yang terbentuk dari kedua nukleotida yang mengakibatkan semakin stabil dan kuat ikatan yang terbentuk. Hasil penelitian yang telah didapatkan, selanjutnya dipublikasikan ke dalam book chapter yang berjudul “Identifikasi dan Analisis Protospacer Adjacent Motif (PAM) SARS-CoV-2 di Indonesia: Studi In silico”. Book chapter ini telah divalidasi terlebih dahulu oleh ahli materi, ahli media, dan pengguna. Skor validasi yang didapatkan dari ahli materi adalah 88% yang dikategorikan sangat layak, ahli media 78% yang termasuk kategori layak, dan skor rata-rata validasi dari pengguna sebesar 97% yang termasuk kategori sangat layak. Berdasarkan hal tersebut, nilai rata-rata validasi dari seluruh validator adalah sebesar 91% dan dikategorikan sebagai book chapter yang sangat layak untuk dijadikan bahan bacaan.