Pembuatan Antibodi Poliklonal untuk Deteksi Protein Wee1 pada Sel Tanaman Padi

Abstract

Wee1 menjadi salah satu protein kinase yang berperan penting pada proses pembelahan sel juga berperan sebagai inhibitor dari checkpoint siklus sel. . Wee1 berperan memfosforilasi cyclin dependent kinase 1 (CDK1) dan menginaktivasiya sehingga sel tidak dapat membelah. Regulasi Wee1 telah dimanfaatkan untuk meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman. Overekspresi Wee1 penelitian sebelumnya belum sampai pada analisa ekspresi protein sehingga perlu pembuatan antibodi untuk mendeteksi protein Wee1. Konstruksi gen Wee1 pada plasmid pET-28(a) dan telah dilakukan transformasi pada bakteri Escherichia coli strain BL 21. Penelitian sebelumnya mengkonfirmasi ekspresi gen Wee1 dan telah didapatkan protein Wee1 murni hasil purifikasi. Protein Wee1 murni hasil purifikasi digunakan sebagai antigen pada hewan uji coba untuk menghasilkan antibodi poliklonal. Teknik analisa protein berbasis antibodi salah satunya yaitu western blot. Metode penelitian yang akan dilakukan yaitu pembuatan antibodi poliklonal protein Wee1 pada hewan coba kelinci dengan cara injeksi antigen protein Wee1. Injeksi dilakukan dengan mencampur antigen protein rekombinan Wee1 sebanyak 1 mg dengan Freund’s Complete Adjuvant (FCA) sebanyak 1 ml perbandingan 1:1. Dua minggu setelahnya dilakukan booster injeksi dengan mencampur antigen protein rekombinan protein Wee1 sebanyak 0.25 mg dengan Freund’s Incomplete Adjuvant (FIA) perbandingan 1:1 sebanyak 1 ml sampai homogen. Injeksi antigen pada hewan coba dilakukan secara subkutan dari minggu kedua sampai kesembilan. Pengambilan serum darah dilakukan pada minggu pertama sebagai pre-imunisasi dan minggu keempat hingga minggu kesepuluh. Serum diuji ouchterlony untuk menganalisa reaksi antigen-antibodi dengan terbentuknya garis presipitasi . Uji sensitifitas dilakukan pada serum pre imunisasi dan serum ke III. Karakterisasi bakteri Escherichia coli dilakukan dengan membandingkan

ix

konsentrasi IPTG 0 dan 0.5 mM yang akan diamati setiap dua jam sekali dengan mengukur Optical Density (OD) menggunakan spektrofotometer (λ= 600 nm). Deteksi protein Wee1 dilakukan dengan mengekstraksi bakteri Escherichia coli dan tanaman padi kemudian dilakukan analisa western blot untuk mengetahui adanya pita protein Wee1 menggunakan serum antibodi poliklonal. Hasil penelitian pembuatan antibodi berhasil dilakukan yang menghasilkan total serum 24.700 uL baik serum pre imun hingga serum minggu kesepuluh. Serum selanjutnya dilakukan uji ouchterlony yang menunjukkan adanya garis presipitasi sangat tipis pada serum pre imun dan serum pertama kemudian mulai menebal pada serum kedua hingga kelima. Garis presipitasi mulai tipis pada serum keenam hingga serum terakhir. Serum pre imun dilakukan analisa western blot tetapi tidak ada pita protein yang terlihat. Serum ketiga menunjukkan bahwa sensitiftas antibodi poliklonal Wee1 terlihat hingga konsentrasi protein Wee1 0.1 ug. Kurva pertumbuhan bakteri menunjukkan peningkatan pertumbuhan bakteri E.coli BL21 Wee seiring pertambahan waktu. Bakteri E.coli BL21 Wee tanpa induksi IPTG menunjukkan pertumbuhan lebih tinggi dibandingkan dengan penambahan IPTG 0.5 mM. Hasil western blot menunjukkan crude extract protein insoluble pada jam ke-6 dan ke-18 menunjukkan adanya pita protein Wee1. Ekspresi protein Wee1 lebih tebal dengan penambahan IPTG 0.5 mM pada perlakuan setelah 6 jam setelah ditumbuhkan. Deteksi protein Wee1 pada tanaman padi (Oryza sativa L.) dengan konsentrasi 30 ug menunjukkan pita protein terdeteksi pada fraksi soluble dan insoluble diseluruh bagian daun, batang, bunga, dan biji.