Pemurnian Endo-β-1,4-D-Xilanase Rekombinan XynBTN63D dari Saccharomyces cerevisiae BJ1824 dengan Fraksinasi, Dialisis, dan Fast Protein Liquid Chromatography

Abstract

Endo-β-1,4-D-xilanase (EC 3.2.1.8) merupakan enzim xilanolitik yang dapat memutus ikatan β-1,4-D-xilosida rantai xilan melalui reaksi endohidrolisis dan menghasilkan xilooligosakarida. Xilooligosakarida (XOS) merupakan gula oligomer yang dihasilkan dari hidrolisis xilan. Xilan merupakan biopolimer paling melimpah kedua di bumi yang dapat ditemukan di jerami, kulit kopi, tongkol jagung, dan lain sebagainya. Xilooligosakarida dapat dimanfaatkan sebagai prebiotik dan pengganti glukosa. Enzim endo-β-1,4-D-xilanase diisolasi pertama kali dari bakteri Bacillus sp. asal abdominal rayap tanah. Enzim tersebut kemudian dimutasi dengan penggantian asam amino asparagin (N) menjadi asam aspartat (D) pada posisi 63. Mutasi gen tersebut menghasilkan gen rekombinan xynBTN63D. Gen tersebut telah disisipkan pada plasmid shuttle vector pESC dan pYHM1. Gen xynBTN63D memiliki sekuens pengkode sinyal peptida HM1 pada ujung N, pengkode enzim endo-β-1,4-D-xilanase, dan pengkode residu polihistidin (His-tag) pada ujung C. Gen tersebut telah diekspresikan secara ekstraseluler pada sel ragi Saccharomyces cerevisiae BJ1824. Saccharomyces cerevisiae BJ1824 merupakan organisme yang dinilai aman dikonsumsi oleh U.S. Food and Drug Administration. Enzim endo-β-1,4-D-xilanase rekombinan XynBTN63D perlu dimurnikan untuk meningkatkan aktivitas spesifik enzim dan menghasilkan lebih banyak xilooligosakarida. Pada penelitian ini enzim endo-β-1,4-D-xilanase rekombinan XynBTN63D dimurnikan melalui tiga tahapan pemurnian yaitu fraksinasi dengan amonium sulfat, dialisis, dan kromatografi afinitas dengan resin Ni-NTA. Fraksinasi amonium sulfat bertujuan untuk memekatkan enzim. Dialisis bertujuan untuk memisahkan enzim dari garam amonium sulfat. Kromatografi afinitas bertujuan untuk memurnikan enzim dengan memanfaatkan interaksi antara residu polihistidin (His-tag) dengan resin Ni-NTA. Enzim endo-β-1,4-D-xilanase rekombinan XynBTN63D diperoleh dari proses produksi pada media Yeast Peptone Galactose (YPG) dengan suhu 30°C selama 3 hari. Ekstrak kasar ekstraseluler memiliki aktivitas spesifik 2,883 U/mg dari plasmid pESC-xynBTN63D dan 2,746 U/mg dari plasmid pYHM1- xynBTN63D. Ekstrak kasar ekstraseluler kemudian digunakan sebagai sampel pemurnian enzim karena memiliki aktivitas spesifik yang lebih tinggi. Ekstrak kasar ekstraseluler ditambahkan dengan garam amonium sulfat kemudian dipilih fraksi dengan aktivitas spesifik tertinggi yaitu fraksi 60% amonium sulfat. Aktivitas spesifik fraksi 60% amonium sulfat yaitu 3,070 U/mg dari plasmid pESC-xynBTN63D dan 3,063 U/mg dari plasmid pYHM1-xynBTN63D. Kedua fraksi kemudian dimurnikan dengan dialisis menggunakan membran selulosa dan buffer fosfat-sitrat pH 5,5. Aktivitas spesifik dialisat dari plasmid pESCxynBTN63D yaitu 3,465 U/mg dan dari plasmid pYHM1-xynBTN63D yaitu 3,381 U/mg. Dialisat enzim kemudian dimurnikan dengan kromatografi afinitas dengan sistem fast protein liquid chromatography (FPLC) menggunakan resin Ni-NTA. Fraksi enzim murni yang memiliki aktivitas tertinggi yaitu fraksi ke-14 dengan aktivitas spesifik 4,817 U/mg dari plasmid pESC-xynBTN63D dan 4,718 U/mg dari plasmid pYHM1-xynBTN63D. Faktor kemurnian enzim endo-β-1,4-Dxilanase rekombinan XynBTN63D dari plasmid pESC-xynBTN63D yaitu 1,67 kali lipat dan dari plasmid pYHM1-xynBTN63D yaitu 1,72 kali lipat. Seluruh sampel enzim telah dianalisis berat molekulnya dengan elektroforesis SDS-PAGE pada setiap tahapan pemurnian dan menunjukkan pita protein pada ukuran sekitar 30 kDa. Xilooligosakarida hasil hidrolisis oat spelt xylan oleh enzim endo-β-1,4- D-xilanase rekombinan XynBTN63D murni merupakan xilobiosa (X2) yang berpotensi dimanfaatkan sebagai prebiotik.