Optimasi Metode Slow Freezing Cryopreservation dengan Penambahan Cryoprotective Agents pada Human Periodontal Ligament Stem Cells”

Abstract

Periodontal ligament stem cells (PDLSCs) merupakan salah satu sumber primer mesenkimal stem cell yang berasal dari jaringan ligamen periodontal pada gigi yang berperan sebagai sumber alternatif dalam pengobatan regeneratif dan terapi sel, terutama untuk perbaikan jaringan gigi yang rusak. Ketersediaan PDLSCs dalam bank sel diperlukan guna meningkatkan ketersediaan secara klinis. Dalam meningkatkan ketersedian sel secara klinis diperlukan metode kriopreservasi dan agen krioprotektan yang tepat untuk menjaga fungsi dan biological properties pada sel. Kriopreservasi dengan slow freezing merupakan metode yang digunakan karena memiliki kelebihan terhadap potensi kontaminasi agen-agen patogenik yang lebih rendah, namun resiko terhadap pembentukan kristal es yang lebih tinggi. Agen krioprotektan merupakan senyawa kimia yang digunakan untuk melindungi sel selama proses pendinginan dalam mencegah pembentukan kristal es baik intraselular maupun ekstraselular. Fresh PDLSCs (fPDLSCs) dan cryopreserved cPDLSCs pada masing-masing grup cryoprotective agents (CPAs) tidak berbeda secara signifikan (p>0.05) terhadap proliferasi dan aktivitas doubling time pada masing-masing penyimpanan di -80oC dan LN2. Secara morfologi sel PDL dan PDLSCs memiliki tiga jenis bentuk yang dikarakterisasi sebagai sel berbentuk rounded, spindle dan flatten. Koloni sel PDL terbentuk dengan menyerap warna ultra violet pada bagian dasar plate well 6 dengan membentuk sepertiga koloni pada hari ketiga, dua pertiga koloni pada hari keenam, dan koloni penuh pada hari kesembilan. PDLSCs mampu mengekspresikan marker positif mesenchymal stem cell diatas 95% pada CD44, CD73, CD90, dan CD105 serta tidak mengekspresikan marker negatif sel hematopoietik CD19/CD45/HLAix DR/CD34/CD11b. Kombinasi 90% FBS+10% DMSO merupakan kombinasi agen krioprotektan yang tepat dan mampu merekoveri sel paska thawing dengan viabilitas mencapai 81.5% dan 80% pada masing-masing penyimpanan di -80oC dan LN2, yang memiliki kemampuan rekoveri hampir sama dengan penyimpanan menggunakan Cell Banker. PDLSCs mampu mempertahankan laju proliferasi seiring lamanya waktu inkubasi dan memiliki kemampuan doubling time pada waktu 24 dan 48 jam inkubasi. PDLSCs mampu berdifferensiasi menjadi sel adiposit selama 27 hari masa kultur dengan mampu menyerap warna Oil Red O sehingga terbentuk droplet lipid, bulat dan cukup besar. Diferensiasi osteogenik PDLSCs terbentuk menjadi sel osteosit selama 28 hari masa kultur dengan menunjukkan penyerapan larutan Alizarin Red yang mempresentasikan terbentuknya kalsium. Differensiasi khondrogenik PDLSCs terbentuk selama 28 hari masa kultur dengan penyerapan larutan Alcian Blue yang mengindikasikan sintesis proteoglikan oleh khondrosit.