Optimasi Waktu Produksi Endo-β-1,4-Xilanase Rekombinan xynBTN63D dalam Saccharomyces cerevisiae BJ1824

Abstract

Endo-β-1,4-D-xilanase dapat memotong ikatan xilosidik -(1 ) xilan untuk menghasilkan xilooligosakarida, enzim ini diperoleh dari Bacillus sp. dalam sistem abdominal rayap strain AAI-1 dengan gen pengkode xynBTN63D. Enzim xynBTN63D tersebut diperoleh dari hasil ekspresi gen xynBTN63D yang dikloning pada pET30a(+) dalam Eschericia coli BL21 (DE3), gen xynBTN63D tersebut adalah hasil mutasi asam amino asparagin (N) pada posisi 63 menjadi aspartat (D) pada gen xynBT. Gen xynBTN63D disubkloning dari pET30a(+) pada plasmid yeast shuttle vector yakni pESC dan pYHM1 dengan tambahan peptida HM-1 menjadi gen pESC-xynBTN63D dan pYHM1-xynBTN63D. Xilooligosakarida yang dihasilkan adalah prebiotik yang terbukti dapat meningkatkan pertumbuhan probiotik berupa Lactobacillus casei secara in vitro, oleh karena itu host yang digunakan harus memiliki status food grade. Endo-β-1,4-D-xilanase kemudian ditransformasikan dari E.coli TOP 10 ke Saccharomyces cerevisiae BJ1824, hal tersebut dilakukan karena S.cerevisiae merupakan organisme yang aman dengan promotor gen yang kuat dan terdaftar sebagai GRAS (Generally Recognize as Safe) oleh U.S Food and Drug Administration. Oleh karena itu penentuan waktu optimum produksi Endo-β-1,4-D-xilanase perlu dilakukan untuk dapat mempermudah penelitian selanjutnya, dalam memproduksi enzim dengan jumlah yang lebih banyak. Pada penelitian ini dilakukan optimasi waktu produksi Endo-β-1,4-Dxilanase pembawa gen pESC-xynBTN63D dan pYHM1-xynBTN63D dalam Saccharomyces cerevisiae BJ1824 dengan menggunakan kurva pertumbuhan dari S.cerevisiae BJ1824 pada variasi waktu produksi 90 jam dengan pengujian sampel setiap 10 jam sekali. S. cerevisiae dengan strain BJ1824 memiliki waktu optimum produksi pada 70 jam, berdasarkan pada tingginya nilai OD yang terukur yaitu sebesar 2,261 pada pESC-xynBTN63D dan 2,103 pada pYHM1-xynBTN63D. Waktu produksi optimum ini terletak pada akhir fase stasioner dimana jumlah sel S.cerevisiae yang diproduksi berada pada jumlah yang optimum, banyaknya sel S.cerevisiae tersebut akan berpengaruh terhadap waktu optimum produksi Endoβ-1,4-D-xilanase dan jumlah kadar protein yang dihasilkan. Waktu optimum produksi Endo-β-1,4-D-xilanase dapat diketahui berdasarkan nilai aktivitas dari Endo-β-1,4-D-xilanase dengan menggunakan uji miller, waktu optimum untuk memproduksi Endo-β-1,4-D-xilanase diperoleh pada waktu produksi 70 jam. Nilai aktivitas meningkat seiring bertambahnya jumlah sel S.cerevisiae BJ1824 yaitu pada waktu produksi 0-70 jam dan mulai menurun setelah waktu produksi 70 jam. Hasil tersebut juga menunjukkan sel S.cerevisae yang diproduksi memiliki nilai aktivitas untuk memproduksi Endo-β1,4-D-xilanase sehingga dapat dianggap sel hidup. Banyaknya sel Saccharomyces cerevisiae tersebut juga memengaruhi kadar protein yang dihasilkan, kadar protein ditentukan dengan menggunakan metode bradford dan dibandingkan dengan hasil SDS-PAGE untuk dapat menentukan protein target. Kadar protein paling tinggi juga diperoleh pada waktu produksi 70 jam dan akan menurun seiring dengan menurunnya jumlah sel S.cerevisiae, hal tersebut mengartikan semakin banyak jumlah sel S.cerevisiae yang dihasilkan maka akan semakin banyak protein yang terbentuk. Melalui elektroforegram hasil SDS-PAGE juga membuktikan bahwa pada waktu produksi 70 jam menunjukkn pita protein paling tebal pada ukuran 30 kDa, pita protein yang terbentuk menendakan bahwa protein yang dihasilkan merupakan protein target yaitu Endoβ-1,4-D-xilanase. Nilai aktivitas enzim dan kadar protein yang dihasilkan selanjutnya digunakan untuk menentukan aktivitas spesifik dari enzim yang dihasilkan. Nilai aktivitas spesifik enzim paling tinggi yang diperoleh berada pada waktu produksi 70 jam. Hasil aktivitas spesifik dari ekstrak kasar Endo- -1,4-D-Xilanase tersebut membuktikan waktu produksi optimum 70 jam merupakan waktu produksi terbaik