Purifikasi dan Uji Aktivitas Penghambatan Protease dari Protein SLPI Rekombinan

Abstract

Luka merupakan kerusakan struktur anatomi dan fisiologi normal tubuh yang menimbulkan rasa sakit akibat rusaknya jaringan sehingga berdampak pada gangguan fisik, emosional, serta tidak terhindarkan yang dapat mempengaruhi kualitas hidup seseorang. Inflamasi yang terjadi akibat luka akan membuat sistem imun melepaskan neutrofil yang mengaktivasi protease sehingga mengakibatkan kerusakan jaringan. Peningkatan kadar protease pada kondisi peradangan berkepanjangan akan memperlama proses penyembuhan luka. Oleh karena itu dibutuhkan pengembangan konsep percepatan penyembuhan luka agar proses pemulihan dapat terjadi lebih cepat. Obat yang berasal dari protein terapeutik menjadi pengobatan potensial yang telah banyak dikembangkan untuk mengobati berbagai indikasi klinis seperti kanker, kelainan genetik, serta peradangan. SLPI merupakan protein yang memiliki fungsi utama menghambat aktivitas enzim protease seperti enzim kimotripsin sehingga dapat melindungi jaringan dari degradasi yang disebabkan oleh pelepasan enzim proteolitik. Pengembangan proses percepatan penyembuhan luka dapat dicapai dengan cara mengembangkan kandidat obat dari protein terapeutik yang memiliki aktivitas penghambatan protease. Protein SLPI rekombinan merupakan protein terapeutik yang memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai aplikasi di bidang medis sebagai agen percepatan penyembuhan luka. Penelitian yang telah dilakukan sebelumnya yaitu konstruksi plasmid rekombinan pET32b SLPI yang disubkloning dalam pET32b SLPI E. coli TOP10 kemudian ditransformasi dalam E. coli BL21. Ekspresi protein SLPI rekombinan diinduksi menggunakan IPTG 0,5 mM dengan suhu inkubasi 30 °C yang telah dioptimasi. Pada penelitian ini, protein SLPI rekombinan berhasil dilakukan purifikasi menggunakan kromatografi afinitas Ni-NTA dengan kenaikan gradien konsentrasi elusi imidazol. Hasil purifikasi dikarakterisasi dengan elektroforesis SDS PAGE lalu dilakukan pengukuran kadar protein total menggunakan Metode Bradford dan pengukuran kadar protein pita target SLPI SDS PAGE BSA. Hasil purifikasi fraksi elusi 5 dan 6 dilakukan uji aktivitas penghambatan protease terhadap enzim kimotripsin pada media skim milk agar. Berdasarkan hasil penelitian, pengukuran pita protein SLPI rekombinan target memiliki berat 29,095 kDa. Induksi protein SLPI rekombinan menggunakan IPTG 0,5 mM dengan suhu inkubasi 30 °C menghasilkan protein SLPI terlarut dengan area (AUC) sebesar 7795,953 mm2 . Hasil pengukuran area selaras dengan konsentrasi protein, semakin besar area yang dihasilkan maka semakin besar pula konsentrasi protein. Protein SLPI hasil purifikasi fraksi elusi 4 menghasilkan pita protein tunggal berukuran ~29 kDa lalu dilakukan pengukuran kadar protein total Metode Bradford memiliki kadar 663,667 µg/mL, sementara pengukuran kadar protein pada pita target SLPI melalui metode SDS PAGE BSA menunjukkan kadar 433,200 µg/mL. Perbedaan konsentrasi pada 2 metode disebabkan karena Metode Bradford merupakan metode untuk mengukur kadar protein total dalam larutan sementara SDS PAGE BSA merupakan pengukuran kadar pada pita protein target yang diduga protein SLPI rekombinan. Uji aktivitas penghambatan protease dari protein SLPI rekombinan hasil fraksi elusi 4 dalam media skim milk agar terhadap kimotripsin menunjukkan tidak ada zona bening yang terbentuk dibandingkan dengan kontrol negatif 4,3 ± 0,001 mm. Hasil fraksi elusi 5 menunjukkan pengukuran zona hambat 3,6 ± 0,047 mm dibandingkan dengan kontrol negatif 4,5 ± 0,015 mm. Berdasarkan hasil elektroforesis SDS PAGE hasil purifikasi dan pengukuran kadar protein SLPI rekombinan, konsentrasi protein SLPI rekombinan sebanding dengan aktivitas penghambatan protease yang dimilikinya, semakin besar konsentrasi protein maka aktivitas penghambatan terhadap protease akan semakin besar. Protein SLPI rekombinan hasil purifikasi perlu dilakukan analisis lebih lanjut dengan western blot dan uji aktivitas in vitro menggunakan substrat dan enzim spesifik yaitu enzim elastase dan substrat NPN (N-suc-ala-L-ala-L-pro-L-phe-4-nitroanilide).