Desain Dan Konstruksi Guide Rna (Grna) pada Sistem Crispr/cas9 Berbasis Sekuens Gen Xa13 dari Beberapa Varietas Padi (Oryza Sativa)

Abstract

Gen xa13 merupakan gen resistensi resesif terhadap Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) ditemukan pada beberapa varietas padi. Aktivasi gen ini menyebabkan kerentanan ketahanan padi terhadap serangan Xoo karena memicu terbentuknya sukrosa sebagai suplai nutrisi bagi Xoo untuk pertumbuhan dan perkembangannya di dalam tanaman. Gangguan dan penghambatan ekspresi gen resesif pada tanaman dapat memengaruhi dampak negatif gen, dan baru-baru ini dapat dibuat dengan pengeditan genom seperti sistem pengulangan palindromik pendek (CRISPR) interspaced regular interspaced menggunakan CRISPRassociated protein-9 (CRISPR /Cas9) teknologi. Salah satu kunci keberhasilan dalam teknik ini adalah adanya guide RNA (gRNA) yang mudah diadaptasi dan dapat menyasar sekuens tertentu dalam genom sekaligus dirancang secara akurat. Penelitian ini bertujuan untuk merancang dan menyediakan informasi molekuler dari gen xa13 penargetan gRNA dari Xoo menggunakan beberapa alat bioinformatika. basis data GenBank, National Center for Biotechnology Information (NCBI), digunakan untuk mengambil data sekuens gen xa13 dari beberapa varietas padi. Clustal Omega digunakan untuk menentukan daerah konservasi gen xa13 pada kedua varietas dalam kelompok Japonica dan Indica. Selain itu, CHOPCHOP digunakan untuk menghasilkan kandidat gRNA sesuai dengan urutan gen target. Studi bioinformatika menunjukkan bahwa gen xa13 yang ditemukan pada padi kelompok japonica dan indica memiliki lima ekson dalam urutan genomik 2.251 bp pada kromosom 8 yang mengandung domain PQloop. Menggunakan perangkat lunak CHOPCHOP, sekitar 5 kandidat xa13 bertarget gRNA telah dipilih berdasarkan data bioinformatika mereka. Setiap kandidat gRNA terdiri dari 20 nukleotida (nt) dari urutan target diikuti oleh 3 nt dari urutan motif berdekatan protospacer (PAM) dalam urutan (5 ' -NGG) yang menargetkan setiap ekson gen xa13. Sekitar tiga jenis PAM akan ditargetkan DIGITAL REPOSITORY UNIVERSITAS JEMBER DIGITAL REPOSITORY UNIVERSITAS JEMBERix termasuk PAM urutan TGG yang menargetkan ekson 1, PAM urutan AGG yang menargetkan ekson 2, dengan efisiensi 52,51% dan 44,63%. Hasil juga menunjukkan bahwa kelima kandidat gRNA tidak memiliki mismatch yang signifikan dengan nilai ≤1 pada keempat kemungkinan mismatch. Data juga menunjukkan bahwa kandungan GC dari semua kandidat gRNA berkisar antara 55-70%. Konfirmasi menggunakan enzim digesti BsaI menunjukkan bahwa pRGEB32-ori menghasilkan pita tunggal jika dibandingkan dengan vektor:insert yang sudah terligasi yang membentuk dua band sama dengan vektor pRGEB32 sebelum dipotong. Hal ini mengindikasikan bahwa gRNA sudah menempel pada vektor